扩增阻滞突变系统-聚合酶链反应（ARMS-PCR）和下一代测序（NGS）均能检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者的EGFR敏感性突变。本研究旨在明确ARMS-PCR与NGS在检测NSCLC患者EGFR L858R与21号外显子罕见突变共发情况时的差异，以及此类患者对EGFR-TKIs的治疗应答。对5033例NSCLC患者的肿瘤组织（来源于术后标本、肺穿刺活检或纤维支气管镜检查，经甲醛固定、石蜡包埋处理，即FFPE）同时采用NGS和ARMS-PCR检测EGFR突变。研究人群的临床及病理资料通过中国医学科学院肿瘤医院的电子病历系统回顾性收集，并通过电话或短信进行随访。采用Spearman相关分析比较L858R与罕见EGFR 21号外显子突变的突变等位基因频率（MAF），采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析生存数据。
共检测出1024例（20.3%）患者存在EGFR L858R突变，其中54例患者经NGS检测发现同时存在L858R与罕见EGFR 21号外显子突变，而ARMS-PCR未检出这些突变。EGFR 21号外显子最常见的共发致病性突变包括V834L、K860I和L833V。在上述54例患者中，23例接受EGFR-TKIs作为一线治疗，中位无进展生存期（PFS）为16.7个月[95%CI：10.1-50.8个月]，其中15例使用第一代EGFR-TKIs，2例使用第二代EGFR-TKIs，6例使用第三代EGFR-TKIs。值得注意的是，NGS检测发现10例患者同时存在L858R与K860I突变，而ARMS-PCR检测EGFR突变结果均为阴性。在这10例患者中，3例接受EGFR-TKIs一线治疗，中位PFS为11.0个月，客观缓解率（ORR）为100.0%。此外，3例经NGS检测发现L858R与K860I共发突变的患者在术后接受辅助靶向治疗，中位无病生存期为10.0个月。
展开剩余87%存在EGFR L858R与K860I共发突变的NSCLC患者可从EGFR-TKIs治疗中获益，此类突变可通过NGS检测检出，而ARMS-PCR无法检出。因此，建议对NSCLC患者采用NGS检测以明确EGFR突变等驱动变异，尤其是在ARMS-PCR检测结果为阴性时。
研究背景
肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，其中NSCLC是最常见的组织学类型。EGFR突变是NSCLC中最常见的致癌驱动变异之一。常见EGFR突变（L858R和19外显子缺失）约占所有EGFR突变的80-85%，被广泛认为是EGFR-TKIs临床疗效良好的强预测因子。近年来，EGFR-TKIs已成为许多携带常见EGFR突变的晚期NSCLC患者的标准治疗方案，其中L858R是中国患者中最常见的亚型。然而，对于存在复杂EGFR突变（如L858R与罕见EGFR第21外显子突变共发）的NSCLC患者，其治疗响应仍未得到充分研究。特别是，由于试验入组困难，关于此类罕见EGFR突变患者治疗策略的有效临床证据仍然缺乏。
目前，NGS和ARMS-PCR均被广泛推荐用于检测NSCLC中的可靶向EGFR变异。ARMS-PCR作为一种能在少量样本中快速扩增靶DNA序列且成本较低的经典方法，已在多种恶性肿瘤中广泛应用，但此前的研究表明，约5%的NSCLC患者携带ARMS-PCR无法检出的罕见EGFR突变。NGS具有高通量检测目标基因所有区域微小突变的能力，近年来已彻底改变了精准医学中的基因组测序，但其对特定设备和专业知识的需求以及繁琐耗时的检测流程限制了其普及。大多数比较不同检测方法的研究集中于常见EGFR突变，而关于ARMS-PCR与NGS在检测复杂EGFR突变（如L858R与罕见EGFR第21外显子突变共发）方面的差异知之甚少。
为明确ARMS-PCR与NGS在L858R与罕见EGFR第21外显子突变共发的NSCLC患者中的检测差异，本研究在大样本队列中同时进行了NGS和ARMS-PCR检测。此外，通过分析L858R与罕见EGFR第21外显子突变（尤其是K860I）的MAF关联，解释ARMS-PCR假阴性结果的原因。最后，收集并分析患者一线接受EGFR-TKIs治疗的响应情况，为L858R与罕见EGFR第21外显子突变并发的NSCLC患者探索有前景的检测和治疗策略。
研究结果
5033例患者ARMS-PCR与NGS联合检测结果：
2021年1月1日至2023年12月1日期间，对5033例NSCLC FFPE标本同时进行ARMS-PCR与NGS检测，共检出2414例（48.0%）存在EGFR突变。其中，1024例（20.3%）携带EGFR L858R突变，在这部分患者中，有54例经检测发现同时存在L858R与罕见EGFR 21号外显子突变（图1A）。共发EGFR 21号外显子罕见突变的分布情况如图1B所示。本研究中最常见的共发EGFR 21号外显子突变依次为V834L（24.07%，13/54）、K860I（18.52%，10/54）和L833V（14.81%，8/54）。
图1
NSCLC患者中L858R与K860I共发突变情况：
为明确NSCLC患者的致癌驱动变异，所有病例均同时接受NGS与ARMS-PCR检测。结果显示，NGS可检出L858R与罕见EGFR 21号外显子突变的共发情况，而ARMS-PCR仅能识别EGFR L858R突变。值得注意的是，NGS在10例患者中检测到L858R与K860I共发突变，而ARMS-PCR对这10例患者的EGFR突变检测结果均为阴性（图2）。
图2
此外，通过Spearman相关分析发现，L858R与共发的EGFR 21号外显子罕见突变的MAF具有高度一致性（n=54，P<0.001，图3A）。具体而言，在L858R与K860I共发突变的患者中，L858R的MAF与K860I的MAF呈显著相关（n=10，P<0.001，图3B），这提示K860I与L858R可能位于同一突变克隆的同一条等位基因上。另外，在本研究中最常见的共发EGFR 21号外显子突变（V834L）与L858R的MAF也具有高度一致性（n=13，P<0.001）。
图3
靶向治疗与临床结局：
在54例L858R与EGFR 21号外显子罕见突变共发的NSCLC患者中，23例接受EGFR-TKIs作为一线治疗，其中15例使用第一代EGFR-TKIs，2例使用第二代EGFR-TKIs，6例使用第三代EGFR-TKIs。中位随访时间为24.5个月，截至数据截止日期，共观察到15例（65.2%）患者出现疾病进展。最佳疗效评估结果显示，部分缓解（PR）7例（31.8%）、疾病稳定（SD）10例（45.4%）、疾病进展（PD）1例（4.5%）、疗效未评估（NA）4例（18.1%）。ORR为30.4%[95%CI：10.1-50.8%]，中位PFS为16.7个月（95%CI：12.8-20.7个月）（表1）。一线接受EGFR-TKIs治疗时，L858R与EGFR 21号外显子罕见突变共发患者与单纯L858R突变患者的疗效差异无统计学意义。值得关注的是，1例L833V与L858R共发突变的患者接受埃克替尼治疗，PFS达18.4个月。疾病进展后对淋巴结活检标本再次进行DNA-NGS检测，结果显示获得性K852T突变可能是该患者唯一的耐药机制。
表1
在10例L858R与K860I共发突变的患者中，3例接受EGFR-TKIs一线治疗，中位PFS为11.0个月，ORR达100.0%（表2）。此外，3例L858R与K860I共发突变的患者在术后接受辅助靶向治疗，中位DFS为10.0个月。典型病例情况：1例56岁女性患者，右肺上叶肿瘤大小为6.1 cm×6 cm，伴2.3 cm×1.8 cm脑转移灶，确诊为IV期（T4N1M1b）肺腺癌。NGS检测发现其存在L858R（MAF 21.1%）与K860I（MAF 22.8%）共发突变，而ARMS-PCR检测未检出上述突变。该患者接受达可替尼一线治疗，获得11个月的PR（图4）。治疗失败后，对右肺上叶病灶再次活检并进行NGS检测，发现新出现的T790M突变（MAF 34.0%）为其耐药机制。随后患者口服奥希替尼，获得5个月的SD（图4）。
表2
图4
讨 论
NSCLC中可观察到EGFR L858R与21号外显子罕见突变共发的情况，然而此类患者的检测特征及治疗应答仍不明确。本研究发现，与L858R共发最常见的EGFR 21号外显子突变依次为V834L（24.07%，13/54）、K860I（18.52%，10/54）和L833V（14.81%，8/54），且这些突变均无法通过ARMS-PCR检出。尤其值得注意的是，EGFR L858R与K860I共发突变呈现ARMS-PCR检测阴性、NGS检测阳性的特点，且经NGS检出此类突变的NSCLC患者可从EGFR-TKIs治疗中获益。
ARMS-PCR是一种选择性扩增靶DNA序列的经典方法，广泛用于EGFR突变检测，但该技术无法识别罕见或未知突变。有研究表明，超过40%携带EGFR 20号外显子插入突变（ex20ins）的NSCLC患者可能被ARMS-PCR漏检；此前的研究也发现，约5%携带罕见EGFR突变的NSCLC患者无法通过ARMS-PCR检出。与之相反，NGS凭借其大规模并行测序能力和高灵敏度，能够实现大规模基因组测序。本研究中，经NGS检出存在EGFR 21号外显子罕见突变共发的NSCLC患者，其突变均未被ARMS-PCR识别；更特殊的是，NGS检出的L858R与K860I共发突变患者，ARMS-PCR检测结果均为阴性。此外，L858R与K860I的MAF具有高度一致性，这提示两种突变可能位于同一突变克隆的同一条等位基因上。由此推测，由于L858R（c.2573 T>G）与K860I（c.2579 A>T）的碱基替换位点距离过近，导致ARMS-PCR的引物无法正常结合，最终出现完全假阴性结果；而基于杂交捕获技术的NGS可通过探针同时检测这两种突变，从而避免漏检。
此前已有研究探讨复杂EGFR突变与EGFR-TKIs治疗疗效的关联。Zhang等人分析了携带EGFR 19号外显子缺失（Del-19）/21号外显子L858R与罕见EGFR突变共发的晚期腺癌患者一线接受EGFR-TKIs治疗的应答情况，结果显示中位PFS为9.7个月，ORR为60.0%。但对于L858R与EGFR 21号外显子罕见突变共发患者的EGFR-TKIs治疗疗效，目前相关研究仍较为有限。本研究证实，此类共发突变患者可从EGFR-TKIs治疗中获益；尤其重要的是，经NGS检出（ARMS-PCR漏检）的L858R与K860I共发突变患者，对EGFR-TKIs应答良好，中位PFS达11.0个月，中位无病生存期（DFS）达10.0个月。此外，研究者观察到1例L858R与K860I共发突变患者，接受达可替尼治疗后获得11个月的PR，后续因出现T790M突变（常见EGFR突变患者对EGFR-TKIs耐药的最主要机制）而治疗失败。
本研究存在一定局限性：首先，纳入的L858R与EGFR 21号外显子罕见突变共发患者样本量相对较少，需在更大规模队列中开展进一步研究以验证结论；其次，接受第二代或第三代EGFR-TKIs治疗患者的随访时间较短；最后，研究人群中21例患者接受了早期手术切除，10例患者失访。由于第一代与第三代EGFR-TKIs的疗效存在显著差异，且本研究为回顾性研究、患者治疗方案存在个体差异，因此难以直接对比不同方案的ORR、PFS等疗效指标。未来需开展前瞻性队列研究，延长随访时间并扩大突变检测范围，以验证本研究结论并阐明耐药机制。
本研究表明，ARMS-PCR无法检出NSCLC患者中的EGFR L858R与K860I共发突变，而NGS可提供全面的突变信息，有助于优化临床结局。在临床实践中，若仅依赖ARMS-PCR检测结果，可能导致L858R与K860I共发突变患者错失本研究证实有效的EGFR-TKIs治疗机会。因此，应推荐NSCLC患者采用NGS检测EGFR突变等驱动变异，尤其是在ARMS-PCR检测结果为阴性时。
参考文献：
Shi H, Li W, Guo L, Ying J, Hu X. Concurrent EGFR L858R and K860I mutations: PCR-negative but NGS-positive alterations that respond to EGFR inhibitors in non-small cell lung cancer. J Thorac Dis. 2025;17(8):5588-5596. doi:10.21037/jtd-24-1787
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